Karcinogeneza se proučava različitim standardiziranim toksikološkim testovima. Prvi dio ovih testova provodi se in vitro, a - ako su pozitivni - nastavljamo s in vivo eksperimentom. Ovaj eksperimentalni korak-po-korak pristup naziva se PRISTUP TOČKOM ODLUKE, niz pokusa koji se zaustavljaju na kraju svakog ispitivanja kako bi se odlučilo kako nastaviti s ispitivanjem. Postoji pet faza:
FAZA A: struktura i karakteristike kancerogenog spoja;
FAZA: u ovoj fazi kratkotrajnog in vitro testiranja koriste se stanice sisavaca. Najčešće korištene stanice su hepatociti jer se proučava opseg popravka oštećenja koje hepatocit razvije prema ozbiljnosti oštećenja uzrokovanog tvari. Ukratko, ne utvrđujemo samo oštećenje, već koliko je sustava za popravak aktivirala stanica jetre.
Postupak koji se provodi je formiranje 3 kulture hepatocita. U prvoj kulturi hepatociti su zdravi, u drugoj se tretiraju ispitivanom tvari i na kraju u trećoj tretiraju kontrolnom tvari koja je zasigurno kancerogena.Ove tri kulture sadrže radioaktivnu pirimidinsku bazu, koja je tritirani timidin, koji djeluje kao marker.
Ako spoj koji se ispituje izazove mutaciju u DNA, stanica na ovaj problem reagira aktiviranjem sustava za popravak. Komad DNK koji je podvrgnut mutaciji se reže i zahvaljujući djelovanju DNKpolimeraze nedostajući dio zamjenjuje se novim.Za korekciju, DNApolimmeraza koristi nove baze, uključujući tricirani timidin. Ugrađena je radioaktivna baza. Analizom radioaktivnosti određuje se razina mutacije u tretiranim stanicama: što je veća radioaktivnost, veće su mutacije DNA.
U fazi B također se provode ispitivanja na bakterijama kako bi se moglo proučiti postoje li obrnute mutacije. Korištene bakterije su već nositelji mutacija salmonele. Mutacija se tiče sinteze histidina, pa salmonele ne mogu rasti bez histidina. Ove bakterijske kolonije dijelom se uzimaju za tretiranje ispitivanom tvari, dijelom za negativnu kontrolu, a dijelom za pozitivnu kontrolu, zatim se testiraju s poznatim kancerogenom. Ako je ova ispitivana tvar neizravno genotoksična, u medij za uzgoj moraju se unijeti metabolički enzimi. U ovom trenutku postoje 3 kulture koje će se posijati i uzgajati u petrijevim zdjelicama (nema histidina u mediju za uzgoj). Ako nije bilo mutacija kancerogena za ispitivanje, teoretski ih ne bi trebalo biti na pločama . Da je došlo do mutagenog djelovanja karcinogena, možda je promijenila prvu mutaciju i stvorila drugu mutaciju sposobnu za uzgoj bakterija na mediju za kulturu bez histidina. U ovom slučaju druga mutacija koja modificira prvu mutaciju i uzima naziv RETROMUTACIJA Konačno, ako dođe do značajnog rasta u piasta petri, karcinogen je izravan.
Uvijek s in vitro testom moguće je utvrditi kromosomski integritet. Ovaj se test uvijek provodi na stanicama sisavaca i koristi se za ispitivanje otrovnih tvari sposobnih izazvati mutacije na nekim enzimima odgovornim za biosintezu DNA. Tvar za testiranje podvrgava se in vitro analizi Da bi se moglo utvrditi utječe li ispitivana tvar na integritet i broj prisutnih kromosoma, koristi se mikronukleusni test. Mikronukleusi su mjehurići koji se formiraju s dijelom kromatina u unutrašnjosti. Kromatin ugrađen u te mikronukleus može biti ili čitav kromosom ili fragment kromosoma. Mikro jezgre nastaju pogrešnom staničnom diobom koja stvara stanice kćeri s genetskim materijalom koji nije jednako Rezultat ovog ispitivanja bit će određivanje tvari koje su definirane klastogenim i vretenastim otrovima. Klastogena tvar proizvodi mikro jezgre s acentričnim fragmentima kromosoma pa tvar izaziva lom kromosoma, umjesto da otrovna tvar vretena proizvodi mikronukleusi koji se unutar njega nalaze čitavi kromosomi.
Ako tvar koja se ispituje inducira genotoksičnost u jednom ili više ispitivanja, to se definira kao vrlo sumnjivo pa prelazi izravno u fazu D. Ako, s druge strane, ispitivana tvar ne proizvodi nikakav genotoksični učinak, prelazi se u fazu ispitivanja C jer može biti promotor.
FASEC: u ovoj fazi mogu se obaviti ispitivanja in vitro i in vivo.
Za in vitro testove moglo bi se dokazati mogućnost da promotorska tvar prekine jaz-spojeve između normalnih stanica i tumorskih stanica, s posljedičnim prolaskom tvari između dvije stanice.
In vivo test je indukcija tumora kože kod miševa. Tvar za testiranje nanosi se dva ili tri puta tjedno na kožu miša. U roku od 2/3 mjeseca, ako je ova tvar promotor, mogu se pojaviti papiloma formacije. Kod miševa uzimaju se u obzir dva glavna podatka: broj miševa zahvaćenih papiloma i broj papiloma prisutnih na svakoj životinji. Ako tvar djeluje kao promotor i razvije tumor u liječenog miša, to znači da je to doista tvar s promotorskim učinkom.
Nakon što su ti testovi dovršeni, prelazimo na dugoročne in vivo testove.
FASED: u ovoj fazi testiraju se svi spojevi koji se pokažu kao mutageni i svi spojevi koji se ne dokažu kao mutageni. Testovi koji se mogu izvesti su različiti, od kojih su neki testovi provedeni na jetri, plućima i na kraju na dojci.
Test jetre pokazuje stvaranje ne novonastalog tumora, već neoplastičnog žarišta, dakle nečega što se sprema postati tumor. Stanice ovog žarišta već su atipične stanice, stoga su podvrgnute mutaciji i spremaju se postati neoplastične stanice. Nakon određenog vremena, zahvaljujući obdukcijskom pregledu, utvrđuje se stvaranje pre-neoplastičnih žarišta, izračunavanjem broja i opsega ovih pre-neoplastičnih formacija.
Test pluća omogućuje utvrđivanje adenoma, koji je "anomalija stanica plućnog tkiva. Također se u ovom slučaju plućno tkivo štakora pregledava nakon prilično dugog vremena (mjeseci) (ti se adenomi lako mogu identificirati jer su bjelkasti čvorići na plućnom epitelu).
Test dojke omogućuje utvrđivanje tumora u žljezdanom tkivu. Uvijek se procjenjuje broj nastalih adenoma i broj životinja s adenomima.
Ako postoje pozitivni rezultati ovih ispitivanja, ispitivana tvar je doista kancerogena. Na ovom mjestu prelazimo na provođenje skupih testova s vrlo dugim vremenima izvođenja.
FAZA: u ovoj fazi različit broj životinja, od 20 do 50, podvrgnut je dugotrajnim testovima, koji su vrlo skupi i potrebno je dosta vremena za dobivanje određenih rezultata; govorimo o otprilike 1/8 života životinje. Moguće je da tijekom procesa ovih ispitivanja neke životinje uginu, ali se uvijek proučavaju obdukcijom i pregledom histološkog tipa. Odabrane životinje uvijek su štakori i miševi, a samo 70-80% preživi do kraja dugotrajnih testova. Korištene životinje samo su odbijene, što su mlađe, to su osjetljivije na tretmane. Tijekom dugotrajnog testnog razdoblja, istraživaču uvijek pomaže matematičar-statističar, sposoban uzeti u obzir sve prikupljene podatke i reproducirati različite podatke.
Doze testirane na životinjama polaze od najveće tolerirane doze i svih njezinih submultiplesa, te se procjenjuje reakcija doze i odgovora na životinji.
Primjena se uvijek mora približavati putu kojim muškarac može doći u dodir sa ispitivanom tvari, dakle oralnim, kožnim ili respiratornim putem, dok je, ako se ispita kancerogenost lijeka, također korisno izvršiti intravenoznu primjenu.
Grupe testiranih životinja su 4 (po 50 životinja za svaku skupinu):
- NAIF skupina koja nema liječenje;
- Grupa tretirana vozilom;
- Skupina tretirana ispitivanom tvari;
- Skupina liječena poznatim kancerogenom.
Vrlo je važno da broj životinja u svakoj skupini bude što jednakiji. Zapravo, ako postoji prevelika razlika u broju životinja, statistički se test može pokazati lažnim.
Procjene koje se provode su:
- Ukupna učestalost tumora;
- Učestalost nekih tumora;
- Učestalost životinja s više od jedne vrste tumora;
- Broj karcinoma životinja.
Na kraju svih ovih faza ispitivanja, tvar je razvrstana na ljestvicu koju su utvrdili IARC (Međunarodna agencija za istraživanje i razvoj raka) i Agencija za zaštitu okoliša (EPA).
Ostali članci na temu "Studija i evaluacija karcinogeneze"
- Karcinogeneza
- Toksičnost i toksikologija
- Toksikologija reprodukcijskog ciklusa i teratogeneza